2012年公衛(wèi)助理醫(yī)師考試輔導(dǎo)：多肽鏈的降解

　　多肽鏈的氨基酸組成往往是比較復(fù)雜，因此直接分析多肽的氨基酸順序還是很困難的，多采用將多肽鏈進一步降解成為更小的片段，然后再行分析。肽鍵的裂解是一級結(jié)構(gòu)研究工作中的重要問題，它要求裂解點少，選擇性強，而且反應(yīng)產(chǎn)率高，目前主要有化學(xué)法和酶解法兩類。

　　1)化學(xué)法

　　(1)溴化氰法　是最理想的化學(xué)方法，能選擇性斷裂甲硫氨酸所在的肽鍵

　　溴化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點：

　�、僖话愕鞍踪|(zhì)含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段

　�、趯Ｒ恍詮�

　　③產(chǎn)率高達80%以上

　�、茏饔脳l件溫和，在室溫中用幾到十幾小時即可。

　　(2)部分酸水解法

　　Sanger在分析胰島素的一級結(jié)構(gòu)中采用了此法，即用0.1N鹽酸在110℃或用6N鹽酸在37℃水解。這種部分酸水解的方法特異性不強，因此對大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。

　　(3)羥胺法

　　這種方法近十年來開始受人注意，羥胺能專一性地裂解Asn�睪ly的肽鍵，酸性條件下裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。

　　(4)N-溴代琥珀酰亞胺法

　　主要裂解Try處的肽鍵，五十年代研究較多。但由于它也能斷裂Tyr�睭is肽鍵，因此應(yīng)用不廣。

　　2)酶解法

　　酶水解法較化學(xué)法具有更多的優(yōu)越性，使用也更廣泛。因其具有較高專一性，而且水解產(chǎn)率較高，所以可以選擇各種不同專一性的酶進行專一性的斷裂。

　　常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。

　　胰蛋白酶專一斷裂Lys,Arg的羧基側(cè)肽鍵，如果對Lys,Arg,CysH進行化學(xué)修飾可改變胰蛋白酶的斷裂性質(zhì)。

　　(1)賴氨酸的修飾。將Lys用順丁烯二酸酐或甲基順丁烯二酸桿修飾，則胰蛋白酶僅使Arg肽鍵斷裂。

　　順丁烯衍生物在中性pH下穩(wěn)定，胰蛋白酶水解僅使Arg鍵斷裂。在酸性條件下順丁烯衍生物可脫去封閉，此時再行胰蛋白酶水解，則得賴氨酸為末端的多肽。下述為蛋白質(zhì)中的賴氨酸，經(jīng)順丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解的例子。

　　(2)精氨酸的修飾。精氨酸與1，2-和1，3-二羰化合物作用，縮合產(chǎn)物是一雜環(huán)化合物，十分穩(wěn)定。然后胰酶水解僅斷裂賴氨酸殘基末端的肽鍵

　　(3)半胱氨酸的修飾。若肽鏈內(nèi)Lys、Arg均較少，則為了增加胰酶的裂解點，可以將半胱氨酸進行氨乙基化，其產(chǎn)物S�拨陋舶币一�半胱氨酸有類似Lys的結(jié)構(gòu)，胰蛋白酶在水解時，不能識別這微細的變化，從而在半胱氨酸處斷裂。

　　蛋白水解酶的專一性

　　肽鏈的裂解和重組大致有三種情況：一種是非特異性裂解，如酸水解。由于裂解的片段較小，造成分離的困難。因此這種非特異性裂解對大分子肽鏈?zhǔn)遣贿m用的。第二種是特異性裂解，采用兩種以上的專一裂解，然后進行組合，這種方法一般也適用于分子量小于5萬的蛋白質(zhì)。第三種是逐步的專一裂解，首先將某種氨基酸進行化學(xué)修飾，使水解酶專一斷裂某一種氨基酸，分成若干片段，然后解除化學(xué)封閉，再用此酶裂解，使曾被封閉過的氨基酸斷裂。目前傾向于采用這種裂解方式。